Ta prvi primer genetske manipulacije pri kuščarju je ustvaril vzorčni organizem, ki bi lahko pomagal pri nadaljnjem razumevanju evolucije in razvoja plazilcev
CRISPR-Cas9 ali preprosto CRISPR je edinstven, hiter in poceni gen orodje za urejanje, ki omogoča urejanje genoma z brisanjem, dodajanjem ali spreminjanjem DNA. Akronim CRISPR pomeni 'clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats'. To orodje je preprosto in natančnejše od prejšnjih metod, uporabljenih za urejanje DNA.
Orodje CRISPR-Cas9 injicira organizme v fazi zigote (enocelično) s konstrukcijo DNK, sestavljeno iz (a) encima Cas9, ki deluje kot "škarje" in lahko odreže ali izbriše del DNK, (b) usmerja RNA – zaporedje, ki ujema s ciljnim genom in tako vodi encim Cas9 do ciljne lokacije. Ko je ciljni del DNK razrezan, se bo celični stroji za popravilo DNK ponovno pridružili preostali verigi in med tem utišali ciljni gen. Ali pa bi lahko gen 'popravili' z uporabo nove spremenjene predloge DNK v procesu, imenovanem popravilo, usmerjeno v homologijo. Tako orodje CRISPR-Cas9 omogoča genske spremembe z injiciranjem urejanje genov raztopine v enocelično oplojeno jajčece. Ta proces povzroči genetsko spremembo (mutacijo) v vseh naslednjih celicah, ki nastanejo, kar vpliva na delovanje genov.
Čeprav se CRISPR-Cas9 rutinsko uporablja pri številnih vrstah, vključno z ribami, pticami in sesalci, doslej ni bil uspešen pri genskem manipuliranju plazilcev. To je predvsem zaradi dveh ovir. Prvič, samice plazilcev shranjujejo spermo za dolgo časa v jajčevodu, zaradi česar je težko določiti točen čas oploditve. Drugič, fiziologija jajčec plazilcev ima številne značilnosti, kot so upogljive jajčne lupine, krhkost brez zračnega prostora v notranjosti, zaradi česar je težko manipulirati z zarodki, ne da bi povzročili razpoke ali poškodbe.
V članku, naloženem na bioRxiv 31. marca 2019 so raziskovalci poročali o razvoju in testiranju načina za uporabo CRISPR-Cas9 urejanje genov pri plazilcih prvič. Vrsta plazilcev, izbrana v študiji, je bila tropska kuščar se imenuje Anolis sagrei ali pogosteje rjavi anol, ki je razširjen na Karibih. Kuščarji v študiji so bili zbrani iz divje regije na Floridi v ZDA. Ta vrsta je zaradi svoje miniaturne velikosti, dolge gnezditvene sezone in razmeroma kratkega povprečnega časa med dvema generacijama idealno primerna za študij.
Da bi premagali omejitve, s katerimi se trenutno soočajo plazilci, so raziskovalci mikroinjicirali komponente CRISPR v nezrela neoplojena jajčeca, medtem ko so bila jajčeca pred oploditvijo še v jajčnikih samic kuščarjev. Ciljali so na gen tirozinaze, ki proizvaja encim, ki nadzoruje pigmentacijo kože pri kuščarjih in če bi ta gen odstranili, bi se kuščar rodil albino. Ta jasen pigmentacijski fenotip je bil razlog za izbiro gena za tirozinazo. Mikroinjektirana jajčeca nato dozorijo v samici in se nato naravno oplojejo z vneseno samico ali shranjeno spermo.
Posledično so se nekaj tednov kasneje rodili štirje albino kuščarji, kar potrjuje, da je bil gen tirozinaze deaktiviran in urejanje genov postopek je bil uspešen. Ker je potomec vseboval urejen gen obeh staršev, je bilo jasno, da so komponente CRISPR ostale aktivne veliko dlje v materinem nezrelem oocitu in po oploditvi mutirale očetove gene. Tako so mutirani albino kuščarji pokazali manipulirano tirozinazo v genih, podedovanih od matere in očeta, saj je albinizem lastnost, podedovana od obeh staršev.
To je prva študija za učinkovito proizvodnjo gensko spremenjenih plazilcev. Raziskava bi lahko delovala na podoben način pri drugih vrstah kuščarjev, kot so kače, za katere so bili trenutni pristopi do zdaj neuspešni. To delo bi lahko pomagalo pridobiti nadaljnje razumevanje evolucije in razvoja plazilcev.
***
{Ta študija je trenutno poslana v strokovni pregled. Prednatisnjeno različico lahko preberete s klikom na spodnjo povezavo DOI na seznamu citiranih virov}
Vir (i)
Rasys AM et al. 2019. Prednatis. CRISPR-Cas9 Urejanje genov pri kuščarjih z mikroinjiciranjem neoplojenih jajčnih celic. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
